【干货满满】你从哪里来免疫检测的标准曲线?


  在临床免疫学检测中,常以系列浓度标准品测得剂量反应曲线(即标准曲线),并以此推算待测未知标本的浓度。由于不同的拟合曲线存在不同程度的实测值与理论值的偏差,因此各种检测项目的标准曲线需要选择适当的拟合模式,通过选择不同的函数关系式来改善标准曲线绘制的精密度,从而以较少的数据和计算获得较为准确的结果[1]。其常用的函数有插值法和曲线拟合,两者都是依据已知的离散数据来寻找合适的函数表达式。区别在于,插值得到的函数能够穿过已知的点,拟合只求函数图形神似而不求穿过已知点[2]。下面对两种函数模式及分类进行简要的介绍。

  插值法的前提为假定已知数据是准确的,要求以某种方法描述数据点之间所发生的情况,所以插值是找到一个(或几个分段光滑的)连续片段来穿过这些点。插值法需完全拟合试验数据,对数据点的精密度和准确性依赖大[1]。插值法又可分为线性插值法和样条插值法。1.1 线性插值是指将临近的校准点以点对点的方式用一条直线连接起来。如图一中的黄色线段。当数据点个数增加和它们之间距离减小时,线 样条插值法是指将临近的两个校准点以一条曲线连起来,对整个标准曲线上各点间的短片段进行数学计算得到一条曲线。换句话说,就是将全部数据分割成若干部分,每个小部分用插值得到不同的函数,最后用很多不同的函数表达原来的序列,所获得的合成数学函数称为样条函数。如图一中的蓝色曲线。

  样条插值法中最常用的方法是三次样条插值,即将原始长序列分割成若干段构造多个三次函数(每段一个),使得分段的衔接处具有二阶导数连续的性质,也就是各点的光滑衔接。当已知测定数据点较多时,其拟合的效果也和实际结果非常吻合。现在有些自动化的分析仪器中,比如某些型号的全自动化学发光分析仪,计算结果就是使用三次样条插值进行处理的[2,3]。

  在实际工作中,变量间未必都有线性关系,例如免疫学标准曲线一般均为非线性的,这时就需要选择适当的曲线类型来拟合已知的观测数据,并用拟合的曲线方程分析两变量间的关系。曲线拟合就是将离散的测量数据连续化,找到一个解析表达式的连续曲线来最大限度地逼近这些点。并不要求拟合曲线通过所有数据点,而是要求它反映对象整体的变化趋势。常见的拟合模式有指数曲线拟合、对数曲线拟合、双曲线模式、多项式模式、Log-Logit转换、Logistic公式(两参数、四参数)等[3],其中几种常见模式的说明如下:

  双曲线拟合是将测定反应信号对标准品浓度的倒数作图( y = a + b(1/x) ),这种方法对于竞争性免疫测定的数据能拟合出很好的平滑曲线。但在标准曲线的端值,特别是低浓度端,得不到好的拟合。

  多项式拟合是指将测定反应信号对标准品浓度作图。三次多项式(y = a + bx + cx2 + dx3)常被用于竞争免疫测定数据的拟合,其形状像倒状的S形。当试验结果刚好在曲线的升段或者降段时拟合效果良好,但是对于区间较广的情形, 由于其弯曲的波动,三次方程拟合模式不一定很好,且对于一个给定反应值可能会对应两个结果,因此需要对校正曲线 Log-Logit转换

  Log-Logit转换曲线拟合是指将logit(B/B0)对标准品浓度的对数作图,经过转换后,进行最小平方回归可得到良好的直线。这个模型一般适用于竞争法的拟合,所以拟合时要求至少有一个零浓度测试的OD值,并且此值为整个反应的最大值(也就是我们常说的至少要做一个空白对照)。

  Logistic公式拟合是指将测定反应信号对标准品浓度的对数作图。所谓四参数拟合,是指用含有四个参数的方程表示因变量y(如吸光度值)随自变量x(如浓度值)变化的规律,公式为y = (a – d) / [1 + (x/c)b] +d,其中a为最大反应值,b为斜率,c为拐点浓度,d为本底,R2为曲线拟合度,用来评价曲线拟合效果。结果输出时要求求出a, b, c, d四个参数使曲线。曲线的形状根据实际情况, 可能是一个单调上升的类似指数、对数或双曲线的曲线, 也可能是一个单调下降的上述曲线, 还可以是一条S形曲线。四参数拟合回归不仅限于竞争法, 实际上夹心法也可使用。在很多情况下它都可以拟合ELISA的反应曲线, 所以它也成了ELISA中应用最广的模型之一[4]。

  在实际应用中选择拟合函数时,除了按照竞争免疫测定和非竞争免疫测定等粗略筛选外,还可以先根据数据做出散点图,然后按照散点图的走势,直观判断确定拟合函数;也可以通过软件(如CurveExpert,GraphPad等),自动做出所有拟合函数下的标准曲线值进行选择。在化学发光免疫分析中,以各拟合模式反求标准品浓度,与其真值比较即可判断拟合模式是否合理。例如有实验室研究结果表明,应用四参数模式拟合甲状腺素化学发光法测定的标准曲线其实测值与线],而以样条函数拟合胰岛素的标准曲线测得的浓度更接近线]。因此免疫分析的标准曲线应进行拟合模式的选择,以便找出与标准品真值最接近的模式,获得最可靠的测定结果。